Worthington核糖核酸测定详细攻略

艾美捷Worthington 核糖核酸背景：

核糖核酸是通过 3',5'-磷酸二酯键连接的核苷酸的长链聚合物。组成碱基是嘌呤和嘧啶的衍生物，糖是 D-核糖。RNA 核苷酸序列是从 DNA 传递的遗传信息，在蛋白质合成中作为氨基酸测序的模板。参见 JD Watson 的基因分子生物学第 3 版（WA Benjamin, Inc., Menlo Park, California 1975）中的第 11 章 - DNA 模板上的 RNA 转录和第 12 章 - RNA 参与蛋白质合成。核糖核酸核心由酵母核酸钠彻底核糖核酸酶水解后剩余的有限多核苷酸组成。

艾美捷Worthington 核糖核酸化学结构：

 

艾美捷Worthington 核糖核酸测定：

Method : 通过在 RNase 测定中用作底物来确定作为 RNase 底物的适用性。由于反应发生的速率不同以及从生物来源分离的 RNA 中核苷酸模式的显着差异，核糖核酸酶活性的标准化一直很困难。克鲁克等人。(1960) 发表了使用合成底物 2', 3'-磷酸胞苷的测定。Zimmerman 和 Sandeen (1965) 描述了一种使用聚胞苷酸的灵敏测定。

Kalnitsky 等人的方法。（1959）在沃辛顿使用。酵母 RNA 在 pH 5.0 的水解速率是通过测量在规定条件下释放的酸溶性寡核苷酸的量来确定的。在指定条件下，一个单位会导致 A260 在 37°C 和 pH 5.0 下的吸光度增加 1.0。

试剂：

0.10 M 醋酸钠缓冲液，pH 5.0：将 5.75 ml 冰醋酸溶解在 900 ml 试剂级水中。用 5 N NaOH 将 pH 值调节至 5.0，并用试剂级水使最终体积达到 1000 ml。

含有 0.75% 乙酸双氧铀的 25% 高氯酸：将 50 ml 70% 高氯酸 (HClO 4 ) 溶解在 90 ml 试剂级水中。添加 750 mg 乙酸双氧铀 (MW 424.15) 并搅拌溶解。

RNA 溶液：将 100 mg Worthington 核糖核酸 (RNA) 溶解在 10 ml 0.1 M 醋酸钠缓冲液中，pH 5.0 轻轻搅拌以溶解以防止变性。在 0.10M 醋酸钠 pH 5.0 中以 1:50 稀释度记录 A260，以确定 mg RNA/ml。mg RNA/ml = A260 x 稀释度 x 0.04

在 0.10M 醋酸钠中稀释至 2.5 mg/ml RNA，pH 5.0 用于测定。测定前在 37°C 下孵育 5-10 分钟。准备一份待测 RNA 溶液，以及另一份不同批次 RNA 的溶液用作对照。

RNAse：

在试剂级水中制备 1 mg/ml 的储备溶液。

在即将进行测定之前，在 0.10 M 醋酸钠，pH 5.0 中进一步稀释至每毫升 2、4 和 6 微克。

程序：

确定 % Native RNA：将 10 mg RNA 溶解在 10 ml 0.015% NaCl 中。在 NaCl 中按 1:50 稀释，将 3 ml 移液器移入比色杯中，在 260 nm 和 320 nm 处读数。加入 0.2 ml 5N NaOH（新鲜，储存在塑料中）。在 260 和 320 nm 处读取。在 37°C 下静置一小时。在 260 和 320 nm 处读取。确定 % Native：（如果低于 60%，请联系主管。）。

A320 是对无关背景的检查。

RNase Blank Assay：（可通过 RNase 检测设置）为样品 RNA 设置空白，为测试 RNA 设置空白。将 1 ml 0.10M 醋酸钠缓冲液 pH 5.0 移入离心管中。平衡至 37°C。加入一毫升 RNA 溶液（2.5 毫克/毫升）。让我们在 37°C 设置一小时。然后加入一毫升乙酸双氧铀-高氯酸溶液。转移到冰浴中冷却 5 分钟。离心澄清并用试剂级水将 0.1ml 澄清上清液稀释至 3.0ml。阅读 A260 与空白。在 37°C 下，空白在一小时内不应增加超过 50%。

RNase Assay： 为样品设置一组试管，为对照设置一组试管。包括带有样品管组的空白和带有对照管组的空白。移取一毫升相应的酶稀释液到离心管中；吸取 1 ml 0.10M 醋酸钠缓冲液 pH 5.0 到空白管中。将所有试管在 37°C 下孵育 58 分钟。每隔一段时间，将 1 ml RNA 溶液 (2.5 mg/ml) 添加到所有试管（样品、对照和空白）中。将每管准确孵育 4 分钟，加入 1 ml 乙酸双氧铀-高氯酸溶液终止反应。转移到冰浴中冷却 5 分钟。离心澄清并用试剂级水将 0.1 ml 澄清的上清液稀释至 3.0 ml。阅读 A260 与空白。

计算

单位/mg dw = (A260 - 空白) x 30 x 稀释 x 标准化因子

注意：由于用作底物的 RNA 来源于天然来源，因此会出现批次间差异。为了克服这一点，运行核糖核酸酶标准并将值调整为标准。示例：如果分配给标准的值为 2500 u/mg，而获得的标准值为 2000 u/mg，则将 1.25 的系数应用于化验值。

Worthington核心酶：包括：胶原蛋白酶，脱氧核糖核酸酶I，弹性蛋白酶，木瓜蛋白酶，核糖核酸酶，胰蛋白酶等。